Role of Ectodermal-neural cortex 1 protein in human glioma progression, identification of a peptide internalized by human glioblastoma cells and development of an alternative method to generate growth curves of adherent cultures / Papel da proteína Ectodermal-neural cortex 1 (ENC1) na progressão de glioma humano, identificação de um peptídeo internalizado por células de glioblastoma humano e desenvolvimento de um método alternativo para gerar curvas de crescimento celular

Gliomas are the most common form of primary intracranial malignancy, among which astrocytomas are the most frequent. Ectodermal-cortex protein 1 (ENC 1), also known as Nuclear Restricted Protein/Brain (NRP/B), was first characterized as a protein which interacts with the cytoskeleton by binding to actin through Kelch-like domains, being related to neural fate specification during development of the nervous system. The first chapter of this thesis confirms ENC1 as a tumor suppression properties by a genomic edition approach, analyses ENC1 expression in a set of patient glioma samples and describes the correlation these data with patients survival and progression-free survival, concluding that ENC1 expression may constitute a biomarker for glioma aggressiveness. The second chapter refers to the identification and in vitro characterization of the LHTNELQ peptide, which was selected by the Phage Display method using human glioblastoma cells. This new peptide is able to be internalized by these cells and features as a new tool for the development of glioma therapeutics. The third chapter report an alternative method to generate growth curves of adherent cell cultures, which is based on the CFSE fluorescence decay over time. It is an alternative method to determine growth curves of cultured cells, with smaller variation among technical replicates than that of counting-based methods

Gliomas são a forma mais comum de malignidades primárias intracranianas, dentre os quais os astrocitomas são os mais frequentes. A proteína Ectodermal-neural cortex 1 (ENC1), também conhecida como Nuclear Restricted Protein/Brain (NRP/B), foi primeiramente caracterizada como uma proteína que interage com o citoesqueleto por meio de ligação à actina através de domínios Kelch-like, sendo relacionada com diferenciação neuronal durante o desenvolvimento do sistema nervoso. O primeiro capítulo desta tese descreve confirmação da capacidade supressora tumoral de ENC1 por abordagem de edição genômica, analisa a expressão de ENC1 em um conjunto de amostras de pacientes com gliomas e correlaciona esses dados com tempo de sobrevida geral e sobrevida livre de progressão tumoral nos pacientes, concluindo que a expressão de ENC1 pode ser utilizada como um biomarcador da agressividade do glioma. O segundo capítulo apresenta a identificação e caracterização in vitro do peptídeo LHTNELQ, que foi selecionado pela metodologia de Phage display utilizandose de células de glioblastoma humano. Este novo peptídeo é capaz de internalizar-se nestas células e figura como uma nova ferramenta para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para glioblastomas. No terceiro capítulo propõe-se um método alternativo para gerar curvas de crescimento celular de cultura aderente, o qual é baseado no decaimento da fluorescência do reagente CFSE ao longo do tempo. Tratase de um método alternativo para a determinação de curvas de crescimento de culturas aderentes, com menor variação entre as réplicas técnicas do que os métodos baseados em contagem das células

EGFR, p53, IDH-1 and MDM2 immunohistochemical analysis in glioblastoma: therapeutic and prognostic correlation / Análise imunoistoquímica para EGFR, p53, IDH-1 e MDM2 em glioblastoma: correlação terapêutica e prognóstica

We studied 36 glioblastoma cases at HC-UNICAMP from 2008 to 2012 and classified the immunohistochemical distribution of the wild-type epidermal growth factor receptor (EGFR), mutated forms of p53 protein and isocitrate dehydrogenase-1 (IDH-1) and murine double protein 2 (MDM2). Immunostaining findings were correlated with clinical data and response to treatment (surgery, chemotherapy and radiotherapy). About 97% of the tumors were primary, most of them localized in the frontal lobe. Mean time free of clinical or symptomatic disease and free time of radiological disease were 7.56 and 7.14 months, respectively. We observed a significant positive correlation between expressions of p53 and MDM2, EGFR and MDM2. Clinical, radiological and overall survivals also showed a significant positive correlation. p53 staining and clinical survival showed a significant negative correlation. The current series provides clinical and histopathological data that contribute to knowledge on glioblastoma in Brazilians.

Estudamos 36 casos de glioblastoma acompanhados no HC-UNICAMP de 2008 a 2012 e classificamos a marcação imunoistoquímica da forma selvagem do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), formas mutantes da proteína p53 e isocitrato desidrogenase-1 (IDH-1) e proteína murina dupla 2 (MDM2). Os resultados de imunoistoquímica foram correlacionados com dados clínicos e resposta ao tratamento (cirurgia, quimioterapia e radioterapia). Cerca de 97% dos tumores foram primários, grande parte localizada no lobo frontal. O tempo médio livre de doença clínica ou sintomática e o tempo livre de doença radiológica foram de 7.56 e 7.14 meses, respectivamente. Observou-se correlação positiva entre a expressão das proteínas p53 e MDM2, EGFR e MDM2. Sobrevivências clínica, radiológica e global também mostraram correlação positiva e significativa. A expressão para p53 e sobrevivência clínica mostrou correlação negativa. O estudo fornece dados clínicos e histopatológicos que contribuem para o conhecimento sobre glioblastoma em brasileiros.

Fatores genéticos e ambientais na patogênese, constituição do microambiente tumoral e prognóstico clínico do linfoma de hodgkin pediátrico

O linfoma de Hodgkin classico (LHc) é caracterizado pelo pequeno número de células de Hodgkin e Reed-Sternberg (H-RS) em meio a um fundo de células não neoplásicas, principalmente T e B. Este microambiente tumoral tem sido considerado uma manifestação imune do hospedeiro contra as células H-RS. Uma vez que crianças e adultos apresentam diferenças quanto a constituição e funcionalidade do sistema imune, além de eventos patogênicos distintos, é de se esperar que o microambiente tumoral no LHc exiba diferenças entre crianças e adultos. Neste estudo, nós analisamos uma série de casos de LHc (100 casos) em relação as características clínico-histológicas, composição do microambiente tumoral através da imunomarcação para CD3, CD4, C-maf, T-bet, FoxP3, CD8, Tia-1, Granzima B (GrB) e CD20, além do impacto prognóstico destas características. O índice de proliferação celular (IPC) das células neoplásicas e benignas foi determinado a partir da imunoexpressão de Ki67. Os polimorfismos de base única (SNPs) da IL10 -1082A/G, -819C/T e -592C/A foram determinados através de PCR alelo-específica. Os SNPs de CTLA4 -1722 A/G, +49 A/G e CT60 A/G foram determinados por descriminação alélica. O vírus Epstein-Barr (EBV) foi determinado por hibridização in situ (EBER-ISH) e imunomarcação para LMP1. A idade ao diagnóstico variou de 3 a 18 anos (mediana 14 anos) com 27% dos casos 10 anos ao diagnóstico. A esclerose nodular (EN) foi o subtipo mais freqüente (69%), sendo comum nas crianças >10 anos, seguida da celularidade mista (CM, 23%), distribuída igualmente entre os grupos etários. 44,8% dos casos foram EBV+, sem associação com os grupos etários (10 anos). Os casos de CM estavam independentemente associados ao EBV (p= 0,045) e à relação CD4/CD20 4/mm2 (p= 0,045) estiveram independentemente associados a pior sobrevida livre de eventos (SLE). Um escore prognóstico foi construído e permitiu a separação dos casos em 3 grupos com diferenças na SLE (p= 0,005). Os genótipos da IL10 -1082GG e -592CC e o haplótipo GCC estiveram associados a características histológicas, baixo número de linfócitos Th2 e alto número de células T reguladoras (Tregs). O genótipo do CTLA4 CT60GG foi associado ao maior IPC das células H-RS. O SNP CT60A e o haplótipo +49A/CT60A estiveram relacionados ao maior número de linfócitos CD4+, enquanto o SNP CT60G e o genótipo cT60GG estiverem associados ao maior número de linfócitos CD8+ e Tregs. O haplótipo CTLA4 +49G/CT0G foi independentemente associado a pior SLE (p= 0,036). Em conclusão: 1) O LHc pediátrico no sudeste do Brasil deve ter um padrão epidemiológico intermediário entre o LHc pediátrico visto nas regiões menos e mais desenvolvidas. A histopatogênese da CM deve ser resultante de uma exposição precoce ao EBV num contexto de déficit imune, refletido pela razão CD4/CD20 <1 no microambiente tumoral; 2) Este é o 1º estudo a descrever a composição do microambiente tumoral no LHc pediátrico e a determinar que os SNPs da IL10 e CTLA4 são capazes de influenciar a composição do microambiente tumoral no LHc; e 3) O EBV tem uma influência significante na composição do microambiente tumoral e na modulação da resposta imune contra o tumor

Classical Hodgkin lymphoma (cHL) is characterized by a small number of neoplastic, Hodgkin and Reed-Sternberg (H-RS) cells in a background of non-neoplastic, mainly B and T cells. This tumor microenvironment has been considered to be a manifestation of host immune reactions to malignant cells. Since children and adults have difference in the constitution and functionality of the immune system, and pathogenic events differ in pediatric and adult cHL, it is likely that the tumor microenvironment in cHL may be distinct in the pediatric setting. In this study, we analyzed a series of pediatric cHL (100 cases) regarding the clinical and histological characteristics, as well as composition of the tumor microenvironment by CD3, CD4, C-maf, T-bet, FoxP3, CD8, Tia-1, Granzyme B (GrB) and CD20 immunostain and its prognostic impact. Proliferation index of neoplastic and benign infiltrating cells was determined by Ki67 immunostain. We determined also the IL10 -1082A/G, -819C/T and -592C/A genotype of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and haplotypes by Allele-specific (AS) PCR and CTLA4 -1722 A/G, +49 A/G and CT60 A/G SNPs by allele discrimination with fluorogenic hydrolysis probes (Taqman® Applied Biosystems). Epstein-Barr virus (EBV) was determined by in situ hybridization (EBERs-ISH) and LMP1 immunostain. Age at diagnosis ranged from 3 to 18 years (median 14) with 27% of cases 10 years age group. Nodular sclerosis (NS) was the most frequent subtype (69%) and was more frequent in the >10 years age group, followed by mixed cellularity (MC, 23%) which was distributed equally between age groups. EBV was identified in 44.8% of cases, without preferential association with age groups (10 years). MC cases were independently associated with EBV (P= 0.045) and with a CD4/CD20 ratio 10) exhibiting a shift from more cytotoxic to more suppressive profile along with age. EBV influenced the lymphocyte composition with more CD8+, Tia-1+, GrB+, and T-bet+ (Th1) cells. Extranodal disease (P=0.016) and GrB+ lymphocytes >4 cells/mm2 (P= 0.045) were independently associated with worst event-free survival (EFS). A prognostic score was constructed and allowed to segregate the children in 3 groups with differences in EFS (P= 0.005). IL10 genotypes -1082GG and -592CC and haplotype GCC associated with histological characteristics, low number of Th2 and high number of regulatory T (Treg) cells. CTLA4 CT60GG genotype was associated with high H-RS proliferative index (Ki67>50%). The SNP CT60A and haplotype +49A/CT60A were related with high number of CD4+ T cells, while the SNP CT60G and the genotype CT60GG were associated with high number of CD8+ and Treg cells. The CTLA4 haplotype +49G/CT60G was independently associated with worst EFS (p= 0.036). In conclusion: 1) Pediatric cHL in Southeastern Brazil may have an intermediate epidemiological situation between childhood cHL in underdeveloped and developed regions. Histopathogenesis of MC subtype may result from early exposure to EBV in the context of an impaired immune system reflected by a CD4/CD20 ratio <1; 2) This the 1st study to describe the specific characteristics of tumor microenvironment composition in pediatric cHL and to determine that IL10 and CTLA4 SNPs are able to influence the tumor microenvironment composition in cHL; and 3) EBV-status has a significant influence in the tumor microenvironment composition and likely in the modulation of the imune response against the tumor

Escore TIMI no infarto agudo do miocárdio conforme níveis de estratificação de prognóstico / Score TIMI en el infarto agudo de miocardio según niveles de estratificación de pronóstico / TIMI risk score for acute myocardial infarction according to prognostic stratification

FUNDAMENTO: O escore de risco TIMI (thrombolysis in myocardial infarction) é derivado de ensaio clínico envolvendo pacientes elegíveis para fibrinólise. Como o perfil de risco desses casos difere do encontrado em populações não selecionadas, é importante que se analise a aplicabilidade do escore em condições clínicas habituais. OBJETIVO: Avaliar o manejo e a evolução hospitalar de pacientes internados com infarto agudo do miocárdio conforme estratificação de risco pelo escore TIMI. MÉTODOS: Foram avaliados, retrospectivamente, 103 casos de infarto agudo do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST, admitidos no Hospital Nossa Senhora da Conceição, em Tubarão, nos anos de 2004 e 2005. Os casos foram analisados em três grupos de risco de acordo com o escore TIMI. RESULTADOS: A mortalidade hospitalar pós-infarto foi de 17,5 por cento. No grupo de baixo risco não houve óbito. A mortalidade foi de 8,1 por cento no grupo de médio risco e de 55,6 por cento no de alto risco. O risco de morte para casos de alto risco foi 14,1 vezes maior em relação aos casos de médio e baixo risco (IC95 por cento = 4,4 a 44,1 e p<0,001). A chance de receber fibrinolítico foi 50 por cento menor no grupo de alto risco em relação ao de baixo risco (IC95 por cento= 0,27 - 0,85; p=0,004). CONCLUSÃO: Houve um aumento progressivo na mortalidade e na ocorrência de complicações hospitalares conforme estratificação pelo escore TIMI. Pacientes de alto risco receberam trombolítico menos frequentemente que pacientes de baixo risco.

BACKGROUND: The TIMI (Thrombolysis in Myocardial Infarction) risk score is derived from clinical trial involving patients who are eligible for fibrinolysis. As the risk profiles of these cases differ from those found in non-selected populations, it is important to review the applicability of the score in usual clinical conditions. OBJECTIVES: To evaluate the management and clinical evolution of hospital inpatients with acute myocardial infarction, according to risk stratification by the TIMI score. METHODS: We evaluated, retrospectively, 103 cases of acute myocardial infarction with ST-segment elevation admitted to the Hospital Nossa Senhora da Conceição - Tubarão, in 2004 and 2005. The cases were analyzed in three risk groups according to the TIMI score. RESULTS: The hospital mortality after infarction was 17.5 percent. In the low-risk group there was no death. The mortality was 8.1 percent in the medium risk group and 55.6 percent in the high-risk group. The risk of death in cases of high risk was 14.1 times higher than in the cases of medium and low risk (95 percent CI = 4.4 to 44.1 and p <0.001). The chance of receiving fibrinolytic was 50 percent lower in the high-risk group in relation to the low risk group (95 percent CI = 0.27 to 0.85, p = 0.004). CONCLUSION: There was a progressive increase in mortality and incidence of in-hospital complications according to the stratification by the TIMI score. High risk patients received thrombolytic less frequently than the patients at low risk.

FUNDAMENTO: El score de riesgo TIMI (thrombolysis in myocardial infarction) se derivó de ensayo clínico que implicó a pacientes elegibles para fibrinólisis. Como el perfil de riesgo de esos casos difiere del encontrado en poblaciones no seleccionadas, es importante que se analice la aplicabilidad del score en condiciones clínicas habituales. OBJETIVO: Evaluar el manejo y la evolución hospitalaria de pacientes internados con infarto agudo de miocardio de acuerdo con la estratificación de riesgo mediante la puntuación TIMI. MÉTODOS: Se evaluaron, retrospectivamente, 103 casos de infarto agudo de miocardio con supradesnivelamiento del segmento ST, ingresados en el Hospital Nossa Senhora da Conceição, en Tubarão, en los años de 2004 y 2005. Se analizaron los casos en tres grupos de riesgo según el score TIMI. RESULTADOS: La mortalidad hospitalaria postinfarto fue de un 17,5 por ciento. En el grupo de bajo riesgo no hubo óbito. La mortalidad fue del 8,1 por ciento en el grupo de medio riesgo y de un 55,6 por ciento en el de alto riesgo. El riesgo de muerte para casos de alto riesgo fue 14,1 veces mayor con relación a los casos de medio y bajo riesgo (IC95 por ciento = 4,4 a 44,1 y p<0,001). La probabilidad de recibir fibrinolítico fue el 50 por ciento menor en el grupo de alto riesgo con relación al de bajo riesgo (IC95 por ciento= 0,27 - 0,85; p=0,004). CONCLUSIÓN: Hubo un aumento progresivo en la mortalidad y en la ocurrencia de complicaciones hospitalarias según la estratificación mediante el score TIMI. Pacientes de alto riesgo recibieron trombolítico menos frecuentemente que pacientes de bajo riesgo.

Prognostic significance of occult lymph node micrometastasis in gastric cancer: a histochemical and immunohistochemical study based on 1997 UICC TNM and 1998 JGCA classifications / Significância prognóstica das micrometástases ocultas em linfonodos no câncer gástrico: estudo histoquímico e imunoistoquímico baseado nas classificações UICC TNM de 1997 e JCGCA de 1998

BACKGROUND: Micrometastasis is a single or a cluster of malignant cells inside the lymph node that are not detected by routine histopathological sections. Micrometastasis is related to poorer prognosis in many gastric cancer studies the real significance of these cells is still controversial. AIM: To evaluate if lymph node micrometastasis is a significant independent prognostic factor and important risk factor for recurrence in gastric cancer. METHODS: A total of 1290 lymph nodes from 28 patients with gastric cancer, since 1998 until 2003, treated by radical resection (D2 and modified D3 lymphadenectomies) were studied. Three sections per lymph node were stained by Hematoxilin-Eosin, histochemical (AB-PAS) and immunohistochemical (AE1-AE3) techniques. Kaplan-Meier's survival curves and Log-rank/Cox tests were used in order to compares lymph node micrometastasis positivity, depth (pT) and location of tumor in gastric wall, histologic type, lymphatic, vascular and perineural invasion, lymph node status (pN) and stage. RESULTS: There were worse prognosis and recurrence in patients with positive lymph node micrometastasis related to vascular and perineural invasions, advanced lymph node status and advanced stages. CONCLUSION: Lymph node micrometastasis seems to be a significant independent prognostic factor and important risk factor for recurrence in gastric cancer, in a context of radical D2 lymphadenectomy.

RACIONAL: Micrometástases são um conjunto de células malignas dentro de linfonodo que não são detectadas pelos exames histopatológicos de rotina. Elas são relacionadas a prognóstico mais pobre em muitos estudos sobre câncer gástrico, mas a real significância dessas células permanece controversa. OBJETIVO: Avaliar se micrometástase linfonodal é um fator independente de prognóstico e importante para detectar a recurrência do câncer gástrico. MÉTODOS: Um total de 1290 lifonodos de 28 pacientes com câncer gástrico, de 1998 a 2003, tratados com operações radicais (D2 e D3 modificadas) foram revistos. Três secções por linfonodo foram corados por Hematoxilina-Eosina, histoquímica (AB-PAS) e imunoistoquímica (AE1-AE3). Curvas de sobrevida de Kaplan-Meyer e teste de Log-rank/Cox foram usados para comparar positividade das imcrometástases, profundidade (pT) e localização tumoral na parede gástrica, tipo histológico, invasão linfática, vascular e perineural, estado linfonodal (pN) e estádio onde se encontra a doença. RESULTADOS: Houve pior prognóstico e recurrência nos pacientes com linfonodos com micrometástases relacionadas às invasões vascular e perineural , avançado estado de invasão linfática e estadiamento mais elevado. CONCLUSÃO: Micrometástase parece ser importante e independente fator de risco para recurrência no câncer gástrico no contexto das linfadenectomias radicais D2.